PCR(polymerase chain reaction)

4.1 DNA 의 변성(denaturation):

• 90℃∼96℃로 가열하여 두가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 분리.

• 일반적으로 94℃사용: 높은 온도일수록 단일가닥 DNA로 잘 이행되지만 온도가 너무 높으면 Taq DNA polymerase 역시 activity(활성)가 낮아짐.

• 첫 Cycle에서는 확실한 변성을 위하여 약 5분간 지속시킴.

• 이 후의 cycle에서는 약 1분간 변성시킴.

4.2 Primer 의 결합(annealing):

• 50℃∼65℃에서 진행.

• 30sec~1min.

• 염기 간의 결합은 G, C의경우 세군데 에서 수소결합이 일어나고 A, T는 두군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합 온도 결정.

• Primer design시에 Annealing temperature를 고려해야 함.

• 일반적으로 GC content가 50%가 되는 primer 쌍을 이용하는 것이 바람직.

4.3 DNA의 합성(polymerization, extension):

• 70℃∼74℃에서 시행.

• 1min ~ 1min 30sec.

• Taq DNA polymerase의 합성 속도: 2,000∼4,000 nucleotides/min, 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당.

• 원하는 PCR 산물의 크기가 크 거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장할 수 있음.

• Cycle이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려가는 것도 좋은 방법의 하나이며 마지막 cycle 에는 약 10분 정도 시간을 충분히 주어서 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 함.

5.1 Pipetting & DNA template:

여러 component를 혼합할 때에는 시료간에 오염이 되지 않도록 주의하여야 하며 가능하면 공기를 통한 오염을 방지할 수 있는 tip을 사용하는 것이 좋습니다. 반응물 혼합 시에는 tube를 ice상에 두고서 혼합하여야 상온에서의 잘못 primer annealing에 의한 extension을 방지할 수 있습니다. 이론적으로 Taq DNA polymerase는 최적 온도 이하에서도 반응이 어느 정도 진행됨 으로 상온 등에서 정확하게 annealing되지 않은 primer에 의한 임의의 반응이 진행됨으로써 원하는 size의 product 이외의 non-specific product가 만들어질 수 있습니다.

5.2 Setting up the Laboratory:

PCR은 민감도가 뛰어난 실험이기 때문에 아주 적은 양의 DNA가 오염되더라도 실험에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 그러므로 PCR을 위한 template를 준비하는 곳과 PCR 반응을 하는 곳, 그리고 PCR 후 전기영동 및 분석을 하는 곳은 격리시키는 것이 좋으며, DNase 와 RNase free PCR tube를 사용하는 것이 좋습니다. 모든 시약류는 반드시 autoclave와 filteration을 거친 후 사용하여야 합니다.

5.3 PCR cycling program:

PCR cycling 조건은 PCR의 종류와 주형 DNA, primer 그리고 PCR 기기등에 따라 달라 져야 합니다.

1. Initial denaturation:

   template DNA의 완전한 denaturation이 중요한데 94℃∼95℃에서 2∼3 min 정도로 충분하지만 대부분 5 min 정도 초기 변성 시간을 주는 것이 좋습니다. denaturation 이 충분하지 않으면 primer의 annealing 과 extension이 방해받아 정확한 반응물이 생기지 않을 수 도 있습니다.

2. Denaturation step during cycling:

   보통 94℃∼95℃에서 20∼30 sec 정도이지만 PCR 기기와 tube 등에 따라 시간을 늘리기도 합니다. Template의 GC함량이 높으면 높은 온도와 긴 시간을 사용하기도 하지만 필요 이상으로 변성 온도가 높거나 길면 Taq DNA polymerase의 활성 이 감소됩니다.

3. Primer annealing:

   대개의 경우 annealing 온도는 primer의 Tm 값에 따라 결정됩니다. 온도가 너무 높으면 primer가 annealing 되지 않아 PCR product가 생기지 않게 되고, 온도가 너무 낮으면 non-specific annealing 이 일어나 정확한 PCR product가 생기지 않습니다.

4. Extension (polymerization):

   Taq polymerase의 경우 72℃에서 1초당 약 60개의 염기를 중합시키기 때문에 1 kb 까지는 45 sec정도면 충분합니다. 하지만 대부분의 경우 1kb당 1분정도의 시간이 필요합니다.

5. Cycle number

   대부분의 경우 25∼35 cycles을 진행하고, Template 분자가 10개 이하인 경우에는 40 cycles 정도 진행하면 product을 관찰할 수 있습니다. 그러나 cycle의 수를 무작 정 늘린다고 해서 product의 양이 급격히 늘지는 않으며 오히려 비특이적 밴드가 늘어날 수 있습니다.

5.4 Equipment (Thermocyclers & PCR tubes):

PCR 기기는 기본적으로 PCR 반응을 구성하는 세 가지 온도를 최소한의 시간에 정확하 고 재현성있게 유지할 수 있어야 합니다. 또한 반응 tube에 따라 열전도율의 차이가 있기 때문에 가능하면 thin-walled reaction tube를 사용하는 것이 좋으며 thermal cycler의 block에 꼭 맞는 크기를 사용하여야 합니다.

5.5 PCR reaction components:

1. DNA template:

   Template 양과 질은 PCR에 절대적인 영향을 미칩니다. template가 적을수록 product의 양 역시 비례적으로 감소하게 되며, RNA의 오염은 Mg2+ 이온을 잡아먹어 yield를 낮추게 되고 불 순한 template에는 반응저해제들을 많이 포함 하고 있어 반응의 효율을 떨어뜨립니다.

2. PCR Primers:

   PCR의 많은 요소들 중에서도 primer의 염기서열과 농도는 전체 반응의 성패에 가장 큰 영향을 미치는 요인 중 하나로 다음과 같은 사항들을 고려하여 설계하는 것이 좋습니다. 길이는 18∼24mer가 적당하며 두 primer의 Tm 값의 차이는 5℃ 이내로 하고 가급적 2차 구조가 형성되지 않도록하며 G+C 값은 40∼60%로하여 두 primer의 3′ 사이에 상보결합이 없어야 합니다.

3. Choice of DNA polymerase:

   PCR 반응에 사용하는 Taq DNA polymerase는 0.5∼2.5U/20∼50ul volume 정도가 적당합니다. 비율적으로 너무 많은 효소가 들어가게 되면 높은 glycerol 농도로 인하여 product가 끌리는 현상이나 특이성이 떨어져 불균형적인 결과를 초래하게 되며, 너무 적은 양의 효소를 사용하면 생성물의 양이 부족하게 됩니다.

4. Deoxynucleotide triphosphate (dNTP):

   항상 dNTP의 4가지 요소들은 동일 농도로 사용하여야 합니다. dNTP mixture의 불균 형은 Taq polymerase의 fidelity를 감소시켜 error rate가 증가될 수 있습니다. 또한 dNTP stock은 thawing/freezing에 민감하여 3∼5차례만 반복하여도 활성이 감소하여 올바른 결과를 기대할 수 없습니다. 그러므로 stock은 사용량에 맞게끔 적절하게 배분해놓는 것이 좋습니다. 만일 dNTP의 농도를 증가시키려면 반드시 Mg2+의 농도 역시 증가시켜 주어야 합니다. 높은 dNTP 농도는 free Mg2+을 감소시켜 효소의 반응을 방해하고 primer의 annealing을 감소시키게 됩니다. 일반적으로 사용되는 dNTP의 최종 농도는 각 200∼250uM 입니다.

5. MgCl2 concentration:

   Mg2+은 dNTP와 복합체를 형성하여 효소의 실질적인 substrate로 이용됩니다. free Mg2+의 농도는 dNTP, free pyrophosphate 그리 고 EDTA 같은 ion 결합 물질의 농도에 영향을 받게 됩니다. 최적 의 실험결과를 위해선 적절한 MgCl2의 농도를 사용하여야 하는데 가장 일반적인 농도는 1.5mM (dNTP 각 200uM 일 때)입니다. Mg2+은 효소 활성에 영향을 미치고 double-strand DNA의 Tm 값 을 증가시키는 효과가 있습니다. 과다한 Mg2+은 primer의 비 특이 적인 결합과 background를 증가시키게 됩니다.

6. Reaction overlay:

   PCR 반응을 하는 동안 mixture가 증발되는 것을 방지하기 위하여 mineral oil을 넣어주어야 합니다. 하지만 PCR 기기의 두껑에 히터가 달려있다면 mineral oil을 넣어 줄 필요 없습니다.

6.1 RT-PCR

RT-PCR((Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)이란 P.Seeburg(1986)에 의해 RNA를 찾고 분석하는데 도입된 방법으로 mRNA(messenger RNA)로부터 reverse transcription 과정을 통해 얻어진 cDNA(complementary DNA)를 PCR로 증폭하는 방법이다. 이러한 방법은 RNA 검사의 sensitivity를 높이고 소량의 RNA로부터 염기서열을 분석할 수 있게 하였다. 이 방법은 Northern blot hybridization과 같은 방법을 통해 가능하던 RNA 분석보다 실험방법이 더욱 간단할 뿐 아니라 유전자의 염기서열 결정이 가능하기 때문에 주로 mRNA의 염기서열 및 전사량을 연구할 때 크게 도움을 준다. 염기서열이 알려진 유전자의 경우 RT-PCR을 통해서 전체 길이의 cDNA를 간단하게 합성하여 cloning 할 수 있다.

RT-PCR의 세가지 과정:

1. RNA 분리 과정(이 과정은 Northern Blot을 하기 전에 시행해야 하는 동일한 과정이다)

2. cDNA 합성 과정(reverse transcription)

3. PCR amplification (이 과정은 Genomic DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 과정과 같다)으로 진행된다.

mRNA로부터 reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 제조하는 방법에는 어떤 oligonucleotide를 primer로 사용하는가에 따라 세가지 방법

1. Antisense primer(3’쪽 유전자에 특이성을 지닌 primer)를 이용하여 특정부위 cDNA 제조

2. Random hexamer를 이용하여 전체 mRNA에 상보적인 cDNA 제조

3. Oligo dT primer를 이용하여 전체 mRNA에 상보적인 cDNA 제조가 있다.

6.2 SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)

point mutation 찾기. 유전자내의 변이, 특히 point mutation을 발견하는데 가장 간단하고 신속한 방법이다. PCR 수행시 각하는 방향과 반대 방향으로 PCR을 실시하는 방법이다. 변이가 있을 것으로 예상되는 DNA 특정부위 양쪽으로 적당히 덜어져 있는 부위에 PCR을 실시하기 위한 primer를 제조한 후 PCR로 이 DNA를 증폭시킨다. 이 증폭된 DNA를 검출하기 위해서는 전기영동을 실시해야 하는데 전기영동에 영향을 주는 인자들에는 여러 가지가 있다. 그 중 SSCP에 이용되는 인자는 입자들의 형태에 따라 전기영동시 이동하는 속도가 달라진다는 점을 이용하는 것이다. 한 개의 point mutation만 있는 경우에도 나타날 수 있는 미세한 이동 속도의 차이도 검출해야 하므로 SSCP를 위해서는 agarose gel대신 acrylamide gel이 이용된다. PCR 산물을 전기영동하기 전에 DNA를 변성시킬 수 있도록 NaOH를 가한 후 urea가 포함된 denaturing acrylamide gel에 전기영동하면 변성된 DNA double strand는 두 개의 single strand DNA로 분리되어 전기영동하게 되며 이 때 point mutation이 생긴 시료는 다른 정상적인 시료에서 얻어진 두 개의 DNA band와 다른 위치에 band가 나타나게 된다. 일반적인 염색만으로 변이 여부를 판정할 수 있는 경우도 있으나, 워낙 미세한 차이를 감지해야 하므로 민감도가 높은 silver nitrate 염색을 하는 편이 결과를 판정하기에 편리하다. 과거에는 아주 시료를 변성시킨 후 non-denatured acrylamide에 전기영동하고, 이를 nylon membrane에 transfer한 후 방사성 동위 원소(radioisotope)로 표지된 probe를 붙이는 복잡한 실험 방법이었으나 최근에는 아주 간단한 방법으로 개량되어 널리 쓰이고 있으며, 민감도를 높이기 위해 방사성 동위 원소를 사용할 필요 없이 silver nitrate를 이용하여 건강을 헤치지 않고 간단히 결과를 판독할 수 있게 되었다.

6.3 RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends):

cDNA를 cloning하기 위해서는 cDNA library를 screening하는 방법이 현재 가장 일반적이라 할 수있지만, 이 방법으로 처음 screening을 하여 찾아낸 clone은 대개 전체 cDNA의 일부이며 계속 반복하여 screening을 하여야만 완전한 cDNA를 얻어낼 수 있다. 그러나 이런 과정은 대단히 시간과 노력이 소모되는 작업이며 유전자 자체가 cDNA library에 적은 양으로 존재하는 경우는 더더욱 힘든 일이 될 것이다. 또한 initiation codon부터 termination codon까지 open reading frame(ORF)을 완전히 결정한 경우에도 cDNA의 5’과 3′-끝의 non-coding region 일부는 library screening에서 얻기가 어렵다. 이러한 문제를 해결하고자, 1988년 Frohmann 등은 다음과 같은 방법을 소개하고, 이를 RACE(rapid amplification of cDNA ends)라 이름하였다. 즉, cDNA의 일부 염기서열을 알고 있으면, 이 부분에서 gene specific primer를 합성하고 PCR reaction을 통해 5′ 혹은 3′-end 까지의 DNA를 증폭하는 것이다. 3′-RACE에서는 mRNA의 3′-end에 존재하는 poly(A) tail을 이용할 수 있으므로, down stream primer로 oligo-(dT) primer를 쓴다. 그러나, 5′-RACE의 경우는 gene specific primer로 합성한 1st single strand cDNA의 끝에 TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 사용하여 poly(A) 혹은 poly(C) tail을 인위적으로 만들어 주어야만 한다.

6.4 ISPCR(In Situ Polymerase Chain Reaction):

PCR은 원하는 DNA를 대량으로 증폭시키는 방법이고, in situ hybidization (ISH)은 세포나 조직에 존재하는 극미량의 DNA 및 RNA를 찾아낼 수 있음은 물론 원하는 유전자들의 위치까지 확인할 수 있는 방법이다. ISPCR은 이 두 가지 방법의 장점을 혼합하여 응용한 방법으로서 PCR의 sensitivity와 ISH의 specificity를 고루 갖추고 있다. ISPCR의 실험원리는 일반적인 PCR 방법과 같으나, slide glass 등의 사용에 적합한 ISPCR용 기구가 필요하며 사용하는 기구에 따라 반응시키는 방법들이 다양하게 제시되어 있다. ISPCR은 세포내의 target sequence를 증폭시키는 것으로부터 반응이 시작되며 세포막을 통해 여러 물질(예: PCR 용액에 들어 있는 salt 등)들이 쉽게 이동할 수 있도록 세포막을 HCl, proteinase K 또는 Triton X-100 등으로 처리해 주는 과정을 거쳐야 한다. 이 과정에 이상이 생기면 세포가 손상되거나 파괴되는 수가 있으므로 PCR이 끝난 후에 세포 안에서 증폭된 PCR 산물이 세포 밖으로 빠져나오는 원인이 되기도 한다. 그러므로 적당한 세제의 적절한 선택과 사용이 무엇보다 중요하며 PCR 산물이 세포 밖으로 유출되는 것을 막기 위해서는 single primer pair with complementary tail, biotinylated dNTPs, multiple overlapping primer pair 등을 이용한 방법이 소개되어 있다.현재까지 ISPCR 방법의 효율은 그다지 높지 못한 것으로 알려져 있으며 specificity를 증가시키기 위해서는 DNA probe를 이용한 in situ hybridization을 시행하거나 Southern blot hybridization을 시행하는 것이 좋은 방법이 된다. 효율이 별로 높지 못한 방법임에도 불구하고 ISPCR에 대한 관심이 최근 크게 증가하고 있는 것은 여러 가지 질병들의 조기 발견에 큰 도움을 받을 수 있을 것으로 기대되기 때문이며, 지금도 여러 회사에서 ISPCR에 유용한 기구들을 제작, 판매하고 있으나 더 좋은 기구의 개발이 이루어져 효율을 더욱 높일 수 있다면 ISPCR이 더욱 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

6.5 DDRT-PCR(Differential Display Reverse Transcriptase PCR):

일반적으로 고등동물에서는 약 100,000가지 정도의 서로 다른 유전자가 발현되고 있으며 각각의 세포 한 개에서는 이중 약 15%만이 발현되고 있다. 발생, 분화, homeostasis, 세포주기 조절, 노화, 발암과정 및 세포의 퇴화 등의 과정에서 표현되어 나타나는 유전자들은 전체 유전자들 중에서 일부가 선택되어 나타나는 것이라고 할 수가 있다. 특정 세포에서 발현되는 특정 유전자들을 찾아내기 위하여 주로 사용되는 방법은 subtractive hybridization 또는 differential hybridization 방법이었으나 최근 PCR을 이용하여 유전자를 찾아내는 방법(DDRT-PCR)이 개발되었다. DDRT-PCR이란 서로 다른 세포로부터 RNA를 분리한 후 특정하게 발현되는 mRNA를 찾아내기 위하여 T 염기 10개와 비특정염기 2개가 연결된 oligonucleotide를 primer로 이용하여 cDNA를 합성한 후 이 primer와 비특정 염기서열을 지닌 oligonucleotide를 primer로 이용하여 PCR 하였을 때 나타나는 여러가지 PCR 산물을 비교함으로써 서로 다른 세포로부터 증폭된 PCR 산물에 차이가 있는지 없는지를 확인하는 방법이다. 서로 다르게 증폭된 PCR 산물을 선택하여 이와 같이 증폭된 DNA가 특정 세포에서 특징적으로 발현되는 유전자인지를 보는 것으로 subtractive hybridization보다 방법이 훨씬 간단한 것이 장점이지만, 실험의 sensitivity와 specificity가 낮은 것이 단점이다. 최근 이 방법에 대한 연구가 많이 진행되면서 새로운 더 좋은 방법들이 계속 발표되고 있으므로 최신 논문을 참고로 적절한 조건을 찾아내어 실험을 시행하면 좋은 결과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

특징:

– 서로 다르게 증폭된 PCR 산물을 선택하여 이와 같이 증폭된 DNA가 특정 세포에서 특징적으로 발현되는 유전자인지를 보는 것으로 subtractive hybridization보다 방법이 훨씬 간단한 것이 장점 – 실험의 sensitivity와 specificity가 낮은 것이 단점

6.6 Hot start PCR:

Taq1 polymerase는 37℃에서도 그 활성이 좋기 때문에 간혹 가다가 첫 번째 denaturation 과정이 완전히 진행되기도 전에 primer가 DNA molecule에 붙어서 extension이 일어나는 경우가 있다. 이렇게 낮은 온도에서 annealing이 일어날 경우 primer가 mismatch할 확률이 높고, 따라서 결과적으로 정확도가 떨어지는 band를 얻게 된다. 이것을 막는 방법이 Hot-start PCR를 이용하는 것이다. Hot start PCR에서는 primer가 정확하게 원하는 DNA site에만 붙을 수 있도록 충분한 온도가 된 후에 PCR이 일어나도록 필요한 물질(ex. polymerase, MgCl2, dNTP)을 넣어준다. (물론 그 전에는 안 넣어준다는 말이다.) 이렇게 하면 위에서 말한 것과 같은 mismatch를 피할 수 있어, 상대적으로 clear한 band를 얻을 수 있다.

6.7 RAPD PCR:

RAPD (random amplified polymorphic DNA) PCR은 일반적으로 두 생명체가 계통 유전학적으로 얼마나 유사성이 있는가를 판별할 때 사용한다. PCR할 때 primer가 짧을 경우 genome 상에 여러 군데 달라 붙어서 여러 fragment를 만든다. 이렇게 해서 생겨난 여러 fragment를 전기영동을 사용해서 확인하면 생명체마다 각각 독특한 band를 형성하는데 이것을 가지고 생명체간의 유사성을 판별할 수 있다. 만약 두 생명체가 비슷한 종일 경우에는 band의 모양이 비슷할 것이며, 그렇지 않을 경우에는 서로 많은 차이를 나타낼 것이다. 이 RAPD PCR은 방법이 비교적 간단하고 쉬워 genome sequencing을 하기 전에 대략적인 종간의 관계를 나타내기 위해서 많이 사용된다.

6.8 Touchdown PCR:

방법은 PCR할 때 Tm(melting temperature)을 알기 위해서 하는 PCR 방법이다. PCR 과정에서 매 2 cycle 마다 annealing temperature을 1℃씩 낮춘다. 일반적으로 annealing이 Tm에서 1℃만큼 차이가 난 온도에서 일어날 때 한 cycle에 product의 양이 두배 정도 차이가 난다. Touchdown PCR에서는 2 cycle 마다 온도를 낮췄으므로 1℃에 product의 양이 4배가 차이나는 셈이다. 이것을 이용해서 Tm을 알 수 있다. (즉 온도가 1도 내려갔을 때 product의 양이 4배 증가한 과정에서의 temperature가 Tm이 된다.) 특징적으로 Gene-specific product 를 많이 생성하므로, non-specific amplification을 줄일 수 있는 PCR 방법

6.9 Long Accurate PCR:

일반적으로 PCR로는 많아야 3kb, 좀 더 이상적일려면 1kb 미만의 크기의 DNA를 증폭할 수 있으나 이 방법을 사용하면 5-40kb의 DNA도 증폭할 수 있다. 이 long accurate PCR에서는 polymerase를 두 개 사용하는데, 그중 하나가 minor-proofreading을 할 수 있어서, 긴 DNA를 증폭할 때 error rate를 감소시켜 준다.

6.10 Asymmetric PCR:

Single strand를 얻을 목적으로 이용하는 PCR방법이다. Primer를 두 개 사용하는데 두 primer를 농도가 100:1로 섞어 사용한다. PCR의 초기에 한쪽의 primer는 소비되어 버리고 과잉의 primer에서 single strand DNA가 생성된다

6.11 Nest PCR:

한번 PCR로 증폭한 DNA 단편을 한번 더 내부의 primer를 사용하여 증폭하는 방법이다. 이는 비 특이적 반응을 감소 시키며, PCR을 2회 실시하므로 감도가 상승하는 효과를 얻을 수 있다.

6.12 Inverse PCR:

Inverse PCR은 기존에 서열을 알고 있는 DNA의 양 옆에 서열을 알지 못하는 region이 있고, 이것을 알고자 할 때 많이 이용된다.

6.13 Gradient PCR:

하나의 목적 유전자를 증폭하는 반응조건을 최적화하기 위하여 여러 번의 실험을 수행해야 하는 번거로움이 있었음. 각 단계의 온도 조건에서 시료 block의 첫 lane과 마지막 lane 사이에 최대 20 ℃의 온도 폭 설정이 가능한 gradient 기능을 이용하여 한번의 실험으로 반응조건을 최적화하는 PCR 방법

효과:

• Annealing temp. 를 단계별로 설정하여 최적의 melting temp.를 찾을 수 있음

• Denaturation 단계뿐만 아니라 extension 단계에도 적용 가능

6.14 Real-Time PCR:

Thermal Cycler와 분광 형광 광도계가 일체화된 장치를 이용하여 PCR 증폭 산물의 생성 과정을 real time으로 모니터링하여 해석하는 방법. 지금까지 단순히 DNA 증폭을 목적으로 하는 PCR에 비해 증폭량을 real time으로 모니터 하면서 PCR 하는 방법입니다. Real time PCR은 지금까지의 PCR에 비해 (1)전기영동이 필요없고, (2)반응 사이클 도중에 증폭산물을 확인할 수 있으며, (3)정량적인 결과를 얻을 수 있는 이점을 가지고 있습니다.

특징:

• 신속성: 전기영동이 필요 없음

• 정량성: 증폭이 지수함수적으로 일어나는 영역에서 증폭산물량을 비교할 수 있음(보다 정확한 정량이 가능)

• 역전사효소를 이용하여 total RNA나 mRNA에서 cDNA를 합성한 후, PCR로 목적 cDNA를 증폭하는 RT(Reverse Transcription)-PCR 방법은, 미량의 RNA 시료에서도 분석이 가능하여 RNA 실험에서 중요하게 대두되고 있음