Cloning_with_pyDNA

_             
                | |            
 ____  _   _  __| |___   __ ___
|  _ \| | | |/ _  |  _ \(____ |
| |_| | |_| ( (_| | | | / ___ |
|  __/ \__  |\____|_| |_\_____|
|_|   (____/

Pydna 파이썬 패키지는 분자 생물학의 클로닝을 도와줍니다. 제공하는 기능은 다음과 같습니다.

  • Restriction digestion
  • Ligation
  • PCR
  • Primer design
  • Gibson assembly
  • Golden gate assembly
  • Homologous recombination
  • Gel electrophoresis of DNA with generation of gel images

PCR simulation

하나 예를 들어보겠습니다. 두 가지 PCR을 진행해보려고 합니다 각각 C3, C5라고 이름을 붙였구요. C3는 정상적인 PCR 반응이 가능하고, C5는 Primer에 문제가 있어 PCR이 되지 않습니다.

In [23]:
# 필요한 pydna 라이브러리를 불러옵니다.
import pydna.parsers as parsers
from pydna.amplify import pcr

서열 불러오기

사용된 서열은 ape 파일로 저장되어 있습니다.

In [ ]:
# template template loading
C3 = pydna.parsers.parse("CEACAM3.ape", ds=True)
C3_F = pydna.parsers.parse_primers("C3_F.ape")
C3_R = pydna.parsers.parse_primers("C3_R.ape")

PCR 진행하기

In [24]:
# PCR
C3_pcr_prod = pcr(C3_F, C3_R, C3)

Agarose gel electrophoresis 결과 예측

In [25]:
%matplotlib inline
from pydna.gel import weight_standard_sample, Gel

st = weight_standard_sample("1kb+_GeneRuler")
Gel([st, [C3_pcr_prod]], gel_len=16).run()
No description has been provided for this image

PCR 조건 예측

일반적인 taq polymerase PCR과 pFu를 사용한 PCR의 조건을 예측해보겠습니다.

일반 PCR

In [26]:
# general PCR
print(C3_pcr_prod.program())

Taq (rate 30 nt/s) 35 cycles             |1325bp
95.0°C    |95.0°C                 |      |Tm formula: Biopython Tm_NN
|_________|_____          72.0°C  |72.0°C|SaltC 50mM
| 03min00s|30s  \         ________|______|Primer1C 1.0µM
|         |      \ 58.6°C/ 0min40s| 5min |Primer2C 1.0µM
|         |       \_____/         |      |GC 54%
|         |         30s           |      |4-12°C

Pfu PCR

In [27]:
# Pfu PCR
print(C3_pcr_prod.dbd_program())

Pfu-Sso7d (rate 15s/kb)                 |1325bp
Three-step|          30 cycles   |      |Tm formula: Pydna tmbresluc
98.0°C    |98.0°C                |      |SaltC 50mM
__________|_____          72.0°C |72.0°C|Primer1C 1.0µM
00min30s  |10s  \ 58.0°C ________|______|Primer2C 1.0µM
          |      \______/ 0min19s|10min |GC 54%
          |        10s           |      |4-12°C

Primer anealing 예측

Primer가 template DNA에 어떻게 붙는지를 예상해보겠습니다.

In [28]:
# anealing results
print(C3_pcr_prod.figure())

         5ATGGGGCCCCCCTTGGC...AAAGGAGATGTGGCTTCT3
                              |||||||||||||||||| tm 53.9 (dbd) 58.1
                             3TTTCCTCTACACCGAAGATGCAGCTG5
5GACAAGCCTATGGGGCCCCCCTTGGC3
          ||||||||||||||||| tm 65.9 (dbd) 75.1
         3TACCCCGGGGGGAACCG...TTTCCTCTACACCGAAGA5

추가적으로 C5에 대한 Anealing을 예측해보겠습니다.

In [29]:
# C5 PCR
C5 = parsers.parse("CEACAM5.ape", ds=True)
C5_F = parsers.parse_primers("Cyno_C5-F.ape")
C5_R = parsers.parse_primers("Cyno_C5-R.ape")
C5_pcr_prod = pcr(C5_F, C5_R, C5)

---------------------------------------------------------------------------
Exception                                 Traceback (most recent call last)
<ipython-input-29-2ab9477161e8> in <module>()
      3 C5_F = parsers.parse_primers('Cyno_C5-F.ape')
      4 C5_R = parsers.parse_primers('Cyno_C5-R.ape')
----> 5 C5_pcr_prod = pcr(C5_F,C5_R,C5)

C:\python\envs\py3\lib\site-packages\pydna-2.0.2-py3.5.egg\pydna\amplify.py in pcr(*args, **kwargs)
    451             return anneal_primers.products[0]
    452         elif len(anneal_primers.products) == 0:
--> 453             raise Exception("No PCR products! {}".format(anneal_primers.report()))
    454         else:
    455             raise Exception("PCR not specific! {}".format(anneal_primers.report()))

Exception: No PCR products! Template CEACAM5 2118 nt linear:
Primer New_DNA anneals forward at position 18

No reverse primers anneal...

이런 에러가 나는군요.

No reverse primers anneal...

사용된 reverse primer가 잘못되었기 때문입니다.

마치며

위에서 살펴본 기능들은 다른 상용 프로그램에서 쉽게 사용할 수 있는것들입니다. 그럼에도 불구하고 pydna가 가지는 강점은 자동화가 쉽다는데 있습니다. 수백개의 클로닝을 진행해야 할때는 마우스클릭만으로는 어렵기 때문입니다. 또한 공식문서를 참고 하시면 더 다양한 기능을 사용할 수 있습니다.

ELISA 분석하기

4PL은 ELISA 실험에서 standard curve를 그릴때 가장 흔하게 사용되는 방법입니다.오늘은 ELISA 데이터에 사용되는 4 Parameter Logistic(이하,4PL) Regression을 파이썬을 가지고 해보겠습니다.

0. ELISA?

Enzyme-linked immunosorbent assay의 약자인 ELISA는 항체 항원 반응을 이용해 목적 단백질의 활성이나 결합력을 정량적으로 측정하는 방법입니다. 아주 긴 역사와 전통을 가지고 있는 것으로 자세한 내용은 위키피디아를 참고 하세요.

1. Four Parameter Logistic (4PL) Regression

많은 생물학적 데이터들은 간단한 선형회귀 모델과는 맞지 않습니다. 그래서 보다 복잡한 모델인 4PL이 더 잘 맞습니다. 4PL은 dose response 나 receptor-ligand binding 시험과 같은 실험에 적합합니다. 그래서 유용하죠. 이름에서 알 수 있듯 4개의 매개변수가 필요합니다. 그리고 S형태의 모양을 띄고 있습니다. 수식으로 표현하면 아래와 같죠.

$$ y = \frac{A-D}{1.0+(\frac{x}{C})^B} + D $$

  • x = 독립 변수(예; 처리한 시료량)
  • y = 종속 변수(예; 시료량에 따른 실험결과 값)

4개의 매개 변수가 뜻하는것은 다음과 같습니다.

  • A = 최솟값 (예; 시료를 처리하지 않았을때의 수치)
  • B = 커브의 경사 기울기
  • C = 커브의 중간점 (예; 경사가 급해지는 부분)
  • D = 최고값

위의 수식을 뒤집으면 실험에서 얻은 결과 값(y)로 부터 넣어준 미지의 시료의 값(x)를 알아낼 수 있습니다. 공식은 다음과 같습니다.

$$ x = C\left(\frac{A-D}{y-D}-1.0\right)^\frac{1}{B} $$

2. 실제 응용

ELISA 실험에서 얻은 데이터를 가지고, Standard curve를 그려 4개의 매개 변수값을 구해보겠습니다. 그런 다음 실험 측정값(y)을 통해 거꾸로 사용한 시료의 양(x)을 구해보겠습니다.

2.1. Standard curve 그리기

사용할 라이브러리를 불러옵니다.

In [1]:
# load modules
%matplotlib inline
import numpy as np
import matplotlib.pyplot as plt
from scipy.optimize import curve_fit
import pandas as pd

ELISA reader에서 얻은 데이터를 csv파일로 정리해서 불러옵니다.

In [3]:
# read data
df = pd.read_csv("./data/20171121_4PL_standard.csv")
df = df.iloc[::-1]  # reverse row
df
Out[3]:
Sample Conc Value
14 St15 0.010 -0.009
13 St14 0.031 -0.025
12 St13 0.094 -0.021
11 St12 0.282 -0.015
10 St11 0.847 -0.031
9 St10 2.540 -0.019
8 St09 7.621 -0.009
7 St08 22.862 0.019
6 St07 68.587 0.045
5 St06 205.761 0.094
4 St05 617.284 0.214
3 St04 1851.852 0.432
2 St03 5555.556 0.636
1 St02 16666.667 0.919
0 St01 50000.000 1.047

간단하게 설명하면 Standard 물질을 500,000 ng/ul에서 3배씩 연속희석하여 총 15번 희석했습니다. 각각의 시료에서 얻은 OD 결과값은 value값이고, 농도는 Conc열에 포함되어 있습니다. 그런다음 4PL 함수을 정의합니다.

In [4]:
# define 4pl logistic
def logistic4(x, A, B, C, D):
    """4PL logoistic equation."""
    return ((A - D) / (1.0 + ((x / C) ** B))) + D

scipy.optimize의 curve_fit 기능을 이용해서 수식의 매개변수를 구하고, 각각의 4개 변수를 나타내면 다음과 같습니다.

In [5]:
xdata = df["Conc"]
ydata = df["Value"]
popt, pcov = curve_fit(logistic4, xdata, ydata)
print(popt)

[ -1.93893872e-02   7.36156893e-01   4.39117217e+03   1.23620082e+00]

이제 시각화를 통해 얼마나 curve fitting이 잘되었는가를 확인해보겠습니다. 아래와 같이 numpy를 이용해 선그래프를 그리기 위한 데이터를 만들어봅니다.

In [6]:
import numpy as np

x_fit = np.linspace(0.01, 50000, 50000)
y_fit = logistic4(x_fit, *popt)
y_fit
Out[6]:
array([-0.01930128, -0.01676145, -0.01503393, ...,  1.05665527,
        1.05665753,  1.0566598 ])

이제 실제 데이터는 점으로 표시하고, curve fitting은 선으로 표시하겠습니다.

In [7]:
plt.plot(xdata, ydata, "o", label="data")
plt.plot(x_fit, y_fit, label="fit")
# plt.legend()
Out[7]:
[<matplotlib.lines.Line2D at 0x7f38d743b9b0>]
No description has been provided for this image

앞쪽의 값들은 너무 좁아서 잘 보이지 않네요. 이럴때는 x축을 로그스케일로 변경하면 좀 더 편하게 볼 수 있습니다.

In [8]:
plt.plot(xdata, ydata, "o", label="data")
plt.plot(x_fit, y_fit, label="fit")
plt.xscale("log")
No description has been provided for this image

거의 절반의 샘플에서 0에 수렴하는 결과를 얻었지만, 전체적으로 curve fitting이 잘 된것을 확인할 수 있습니다.

2.2 미지의 샘플농도 구하기

이제 실험 값(y)을 가지고 standard curve에 대입해서 농도값(x)을 알아보겠습니다. 이것이 진짜 ELISA 실험을 하는 이유입니다.

먼저 아래와 같은 함수를 정의합니다.

In [9]:
# 역수를 구해서 OD값에서 conc 값 알아내기
def solvex(y, A, B, C, D):
    """rearranged 4PL logoistic equation."""
    return C * (((A - D) / (y - D) - 1.0) ** (1.0 / B))

위에서 정의한 함수를 가지고 y값이 1.0일때 x축의 값을 계산해보도록 하겠습니다.

In [10]:
solvex(1.0, *popt)  # OD가 1.0일때 Concentration 값
Out[10]:
32007.229532820107

정리하며,

결과값이 32000정도 나왔는데요, Standard curve에 대입해보면 얼추 맞는 것 같습니다.